二軸閉じ込め下の繊維状ヒドロゲル

Nature Communications volume 13、記事番号: 3264 (2022) この記事を引用

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繊維状ヒドロゲルを狭い毛細管に閉じ込めることは、生物学および生物医学システムにおいて非常に重要です。繊維状ヒドロゲルの伸長と一軸圧縮は広く研究されています。ただし、毛細管内の二軸閉じ込めに対するそれらの応答は未調査のままです。今回我々は、圧縮すると柔らかく、伸長すると硬いという構成フィラメントの機械的特性の非対称性により、フィラメント状ゲルは柔軟ストランドゲルとは質的に異なる方法で閉じ込めに応答することを実験的および理論的に示した。強い閉じ込め下では、繊維状ゲルは弱い伸びを示し、二軸ポアソン比がゼロに漸近的に減少します。その結果、ゲルの高密度化が強くなり、ゲルを通る液体の流束が弱くなります。これらの結果は、治療薬による溶解に対する緊張した閉塞血餅の耐性を明らかにし、血管出血を止めたり腫瘍への血液供給を抑制したりするための、繊維構造を有するゲルからの効果的な血管内プラグの開発を刺激するものである。

線維ネットワークは、組織および生細胞の主要な構造的および機能的構成要素です。アクチンは細胞骨格の主要な要素です1。フィブリンは創傷治癒と血栓症の重要な要素であり 2、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンは動物界の細胞外マトリックスの構成要素です 3。繊維状生体高分子の再構成されたネットワークは、組織工学において幅広い用途を持つ材料として登場しました4。

繊維状ネットワークは、柔軟な分子のネットワークとは異なる機械的特性を備えた、生物学的ソフトマターの異なるクラスを表します5。これらの特性の一部は、変形に対する生物物質の反応を制御するために進化の過程で発達しました。たとえば、繊維ネットワークは小さなひずみでは線形弾性を示します 7,8 が、より大きな変形では剛性の増加を示します 9,10 ため、組織の完全性が確保されます。繊維状ゲルの他の機械的特性、たとえばせん断ひずみに応じた負の垂直応力の影響はまだ発見されていません。

半柔軟な繊維状ヒドロゲルの機械的特性は、一軸伸長 13,14 および圧縮 8,15 の下で研究されていますが、狭い毛細管またはチューブ内での閉じ込めによる二軸圧縮については調べられていません。ここでは、実験結果を報告し、マイクロ流体チャネル内の二軸閉じ込め下での繊維状ヒドロゲルの挙動のメカニズムを理論的に提案します。

マイクロ流体アプローチを使用して、フィブリノーゲンとトロンビンの濃度比と直径 D0 が 150 μm から 220 μm まで異なるフィブリンミクロゲルを生成しました (補足図 1)。図 1a は、蛍光色素で標識されたミクロゲルの共焦点蛍光顕微鏡 (CFM) 画像を示しています。ミクロゲルは、CFM (補足情報および動画 S1 および S2) で検査したスケール上で球形、多分散性が 5% 未満、均一な構造を持っていました。ミクロゲルの平均細孔径（ダルシー透過性の測定によって決定16）は2280から60 nmに減少し、フィブリン含有量は5.25から37.9 mg/mLに増加し、トロンビン濃度は2.56から0.27単位/mLにそれぞれ減少しました（補足図2）。、3および補足表1）。対応するミクロゲルの剛性は 0.85 kPa から 3.6 kPa に増加しました (補足図 4)。柔軟なストランドによって形成されるゲルの例として、さまざまな剛性を持つアガロースミクロゲルが使用されました 17。

a TBS に懸濁したフルオレセインイソチオシアネート (FITC) 標識 RM の蛍光顕微鏡画像。スケールバーは500μmです。 b SM (上) と RM (下) の SEM 画像。スケールバーは 500 nm です。 c チャネル-at-large（直径dl）と、テーパ領域の入口角αが15°、直径dc = 65μmの狭窄部を含むマイクロ流体チャネルの概略図。 d 左から右：チャネルアットラージ、テーパーゾーン、および狭窄部（Dzの閉じ込められたゲルの長さ）におけるRM（直径D0）の光学顕微鏡画像。スケールバーは100μmです。 e、f 1/λr = 2.7で狭窄内に1時間閉じ込め、その後解放し、TBS中のグルタルアルデヒドの5重量％溶液で固定した後の、変形していないRM（e）と閉塞RM（f）のTEM画像。変形していないＲＭの直径は１７６μｍであった。スケールバーは100nmです。

我々は、剛性が 0.85、1.87、および 3.6 kPa のフィブリンミクロゲルに焦点を当てました (本文の後半では、それぞれソフトミクロゲル (SM)、中剛性のミクロゲル (MM)、および硬質ミクロゲル (RM) と呼ばれます。この範囲のフィブリンゲルの硬さは血栓について報告されているものと同じオーダーでした 18,19 ため、私たちの研究で研究したフィブリンゲルは実際の生物学的システムと直接の関連性があります図 1b、上と下は走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像を示しています。 SM と RM の構造の違い. SM ネットワークは、RM 構造と比較して、以前の報告 20,21 (補足図 5) と一致して、分岐点が少ない太い繊維によって形成されていました。特性の変化の傾向と相関関係があります: SM、MM、RM と細孔サイズが減少するにつれてゲルの透過性が低下しましたが (補足表 1)、ゲルの剛性は逆の順序で変化しました。 4°Cで保管します（補足図6）。

図 1c は、円形断面のマイクロ流体チャネルの概略図を示しています。このチャネルには、（左から右に）直径 dl のチャネル全体（ミクロゲルが変形せずに残っている）、テーパー領域、直径の狭窄部が含まれています。 dc < D0、テーパー領域、および直径 dl のチャネルアットラージ (補足図 7)。典型的な実験では、マイクロゲルは、0.2〜16 kPaの正の圧力差ΔPの下でマイクロ流体チャネルに導入されました（補足図8）。この圧力範囲は、生物学的に関連する血圧 (120 mmHg = 16 kPa) に相当します22。図 1d (左から右) は、チャネル全体、テーパー領域、および狭窄部の RM の代表的な画像を示しています。ミクロゲルの動きと形状を記録し、MATLAB プログラムを使用して分析しました。重要なことは、テーパー領域とくびれでは、ミクロゲルがマイクロチャネル壁と等角接触していたことです（補足図8）。収縮における放射状ミクロゲルの閉じ込めの程度 D0/dc = 1/λr は、2.4 ≤ 1/λr ≤ 4.2 の範囲内でした。ここで、1/λr は圧縮率です。 ΔP > ΔPtr では、ミクロゲルはくびれを通過しました。ここで、ΔPtr は転座圧力差です。生物学的システムではゲルの粘弾性を考慮することが非常に重要であるため、二軸に閉じ込められたミクロゲルの細孔の長さとサイズは平衡状態で決定されました。平衡化時間は、アガロースミクロゲルでは 10 分、フィブリンミクロゲルでは 30 分でした。これらの時間間隔の後、閉じ込められたミクロゲルは定常状態の位置と形状に達し、それが高速カメラで記録され、MATLAB で分析されました。

図1e、fは、変形していない二軸閉じ込めされたRMの構造の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示しています。 RMが狭窄部に閉じ込められると、以前の報告と一致して、ミクロゲル細孔のサイズは大幅に減少し、その形状は異方性となり、圧縮方向の寸法が小さくなりました。

狭窄部の二軸圧縮により、因子 λz = \({D}_{{{{{\rm{z}}}}}}\)/\({D}_ {0}\)、\({D}_{{{{{\rm{z}}}}}}}\) は閉じ込められたミクロゲルの長さです。図 2a は、フィブリンおよびアガロースミクロゲルの λz 対 1/λr の変化を示しています。驚くべきことに、2.4 ≤ 1/λr ≤ 4.2 の強い圧縮の場合、フィブリンミクロゲルは 1.12 + /-0.03 というわずかな伸び λz を示し、1/λr 値の影響はごくわずかでした。二軸閉じ込めに対するこのような応答は、1/λr = 2.6 の弱い圧縮でも大きな伸び λz = 1.3 が観察された閉じ込められたアガロースミクロゲルの挙動とは顕著に対照的でした。

a さまざまな弾性率（2.6 kPa、緑色の中空ひし形、8.3 kPa、茶色の中空の円、12.5 kPa、オレンジ色の中空の四角、および 20.2 kPa、マゼンタの中空の逆三角形）およびSM（赤色の実線）を持つアガロースミクロゲルの実験で測定された伸びλzの変化。丸）、MM（黒塗りの四角）、RM（青塗りの三角）。実線は、理論的に予測されたアガロース (緑色の線) とフィブリンミクロゲルの λz を示しています (線と記号の色は一致しています)。 b、c 上：二軸圧縮前（左）と二軸圧縮後（右）のアガロース（b）とフィブリン（c）のネットワーク鎖の概略図。下: 変形前後の対応するネットワークの形状。圧縮方向 x と y は、それぞれマゼンタと茶色の矢印で示されています。上の漫画では、これらの x および y 方向に沿って配向されたネットワークストランドは、対応するマゼンタと茶色の色の線として示され、拘束されていない z 方向に配向されたストランドは緑色の線で示されています。フィブリンゲル (c) では、x 方向と y 方向に配向したマゼンタと茶色のストランドが変形していない状態よりも大きく曲がりますが、z 方向に配向した緑色のストランドは曲がったり伸びたりしています。圧縮方向と伸張方向の間の応力は、中間の配向を持つフィラメントを介して伝達されます。アガロースゲルでは、すべての配向のストランドが浸透圧を決定し、これがゲルの変形に大きく寄与します。 d 二軸ポアソン比の予測変動、\({\nu }_{{{{{{\rm{b}}}}}}}^{{{{{{\rm{eff}}}}}}} =-{{{{{\rm{ln}}}}}{\lambda }_{z}/{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{r}\ )、アガロース (緑線) およびフィブリン (赤線) ゲルの等二軸圧縮用。挿入図はゲルの二軸変形を示しています。 e アガロースおよびフィブリンミクロゲルの圧縮比の関数としてプロットされた、ゲル剛性 S によって正規化された転座圧力 ΔPtr の変動。記号の色は(a)の色に対応しています。緑と赤の線は、それぞれアガロースゲルとフィブリンゲルのΔPtr/Sと1/λrの間の理論的関係を示しています。赤い線の点線部分は、繊維間の相互作用による、強い圧縮時の ΔPtr の上昇を示しています。

この違いは、それぞれ柔軟な 24 フィラメントと硬い 25 フィラメントで構成されるフィブリンとアガロースのミクロゲルネットワークの変形機構が異なるためです。柔軟なゲルを二軸圧縮すると、その体積が減少し、それに関連して濃度と浸透圧が増加し、その結果、拘束されていない方向にゲルが伸びます。最終的なゲルの伸びは、伸長鎖のエントロピー自由エネルギーの増加と伸長ゲル中のポリマー濃度の低下による浸透圧自由エネルギーの減少のバランスによって決まります17。強い二軸圧縮の場合、ゲルの伸びは λz ≈ 0.6 \({{\lambda}_{{{\rm{r}}}}^{-2/3}}\) として増加します (図 2a の緑色の線を参照)および補足説明セクション 5.3.3)。二軸閉じ込めの前後の柔軟なストランドの構造の変化と、対応するネットワーク形状の変化を図2bに示します。

顕著な対照的に、フィブリンなどの糸状ゲルは質的に異なる方法で二軸閉じ込めに応答します。主に圧縮方向に平行に配向しているフィラメントは曲がります（したがって、架橋点間の距離が減少します）が、圧縮方向にほぼ垂直であるフィラメントは弾性力によって真っ直ぐに伸ばされ、ゲルが伸びます（図1）。 2c)。変形していない SM、MM、および RM の構造は、SEM および CFM 画像を分析することによって特徴付けられました (補足説明セクション IV および補足図 9)。変形していないフィブリンミクロゲルのフィラメントの弾性率（E）、直径（d）、輪郭の長さ（R0）、端から端までの距離（L0≈R0）、および中心角（ψ0）を決定することによって（補足表2） –4)、フィラメントの曲げ係数 \({k}_{{{{{{\rm{b}}}}}}}=\frac{9\pi E{d}^{4} }{4{\psi }_{0}^{2}{L}_{0}}\) は、その引張弾性率 \({k}_{{{{{{\rm{s}} }}}}}=E\frac{\pi {d}^{2}{R}_{0}}{4}\)、したがって kb/ks ≈ 0.1 (補足表 4)。したがって、ゲルを二軸に閉じ込めると、フィブリンフィラメントは容易に曲がりますが、伸びには抵抗します。二軸圧縮を受けた糸状ネットワークの伸びを補足図17に示します。

我々は、理論的なアフィンモデル（補足議論セクションVおよび補足図10〜16）を開発しました。このモデルでは、繊維状ゲルの伸びがゲル内に作用する弾性力の局所的なバランスから決定され、強い二軸閉じ込めの下でひずみλz −1 を次のように予測しました。

式 (1) は、強い圧縮下 (\({\lambda }_{{{\mbox{r}}}}\,\to \,0\)) の下でも、ゲルの弱い増加とその後の飽和が起こることを示しています。 λz–1 = 0.15 ± 0.05 での伸びひずみ。このような動作は、(i) \({\left({k}_{{{{{{\rm{b}}}}}}}/{k}_{{{{{{\ rm{s}}}}}}}\right)}^{1/2}\) ≈ 0.15−0.4、および (ii) 角かっこ内の項は \(1{{\mbox{/}}} に漸近します) \sqrt{3}\) は強力な二軸閉じ込め用です。重要なのは、プレファクター \({\left({k}_{{{\mbox{b}}}}/{k}_{{{\mbox{s}}}}\right)}^{1/2 }\) はフィラメント剛性 E とは独立しており、フィラメントのアスペクト比 d/L0 と円弧の中心角 ψ0 によってのみ決定されます。これらは SM、MM、RM で同様です (補足表 4)。

柔軟なゲルと糸状ゲルの閉じ込めによって生じるひずみの違いをさらに強調するために、二軸ポアソン比 \({\nu }_{{{{{\rm{b}}}}}}{{\mbox{ =}}}\,\mathop{{\lim}}\limits_{{\lambda }_{{{{{\rm{r}}}}}}\to 1}\frac{{\lambda }_{ {{{{\rm{z}}}}}-1}{1-{\lambda }_{{{{{\rm{r}}}}}}}、\) でのゲルの変形を説明します。 2 つの半径方向の等しい変形に応じて非拘束方向に拡張し、それを大きな一様変形に拡張しました \({{{{{{\rm{\nu }}}}}}_{{{{{{\rm{b }}}}}}}^{{{{{{\rm{eff}}}}}}}=-{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{z} /{{{{{\rm{ln}}}}}{\lambda }_{{{{{{\rm{r}}}}}}\)。図 2d は \({{{{{{\rm{\nu }}}}}}}_{{{{{{\rm{b}}}}}}^{{{{ {{\rm{eff}}}}}}}\) は、柔軟なゲル (アガロースなど) と硬いゲル (フィブリンなど) の均一な二軸圧縮に使用され (補足説明セクション 5.3.4)、それらのゲルの大きな違いを強調しています。監禁への対応。アガロースゲルの場合、強い閉じ込め下では、 \({{{{{{\rm{\nu }}}}}}_{{{{{{\rm{b}}}}}}}^{{ {{{{\rm{eff}}}}}}}\) は 2/3 の漸近値まで増加しますが、フィブリンゲルの場合、λz は λr の増加とともに飽和するため、lnλz/lnλr → 0 としてゼロに減少します。実験では、閉じ込められた球状ミクロゲルは不均一な変形を受け、その中心部分がより強い圧縮を受けましたが、大きな 1/λr への外挿により、均一に変形したゲルの実験と理論の比較が可能になったことに注意してください。

柔軟性ストランドゲルとフィラメント状ゲルの挙動におけるさらなる違いは、狭窄部を通過するゲルの移動に関して見出された。ゲルの剛性Sによって正規化された転座圧力ΔPtrは、圧縮の増加とともに増加しました（図2e）が、2.0≤1/λr≤3.5の場合、フィブリンミクロゲルは実質的に小さなΔPtr/S値で狭窄を通過しました。アガロースミクロゲルを閉じ込めると浸透圧が上昇し、ポリマー分子の伸縮に伴ってゲルが長手方向に伸長し（図2b、左）、移動圧力がΔPtr/S〜（1/λr）として増加しました。 )14/3 17. 対照的に、閉じ込められたフィブリンミクロゲルの形状は、半径方向に圧縮され、長手方向に伸ばされたフィラメントのエネルギーのバランスによって決定され、その結果、最大長手方向の歪み λz ~\(\sqrt{{ k}_{{{{{{\rm{b}}}}}}/{k}_{{{{{{\rm{s}}}}}}}\)。 1/λr ≫ 1 の場合、転座圧の変化は ΔPtr/S 〜\({{\lambda }}_{{{{{{\rm{r}}}}}}^{{-}1 }{{{{{\rm{ln}}}}}}\left({{\lambda }}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{-}1} \right)\) (補足説明セクション 5.4)、図 2e の赤い実線で示すように。したがって、ΔPtr の閉じ込めへの依存性はアガロースゲルよりも弱かった。 1 / λr > 3.5の圧縮の場合、フィラメント体積分率の大幅な増加と隣接するフィラメントの相互作用により、さらなるゲル変形が制限され、実験結果が予測から逸脱しました（図2eの赤い点線）。同じ 1/λr と Δ\({P}_{{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{{\rm{fibrin}}}} }}}}\) < ΔP < Δ\({P}_{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{{\rm{アガロース}}}}} }}}\)、アガロースゲルはマイクロチャネルに捕捉されますが、同じ剛性のフィブリンゲルはマイクロチャネルを通過します。 ΔP < Δ\({P}_{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{{\rm{フィブリン}}}}}}}\) の場合、どちらのゲルもチャネルを妨げますが、フィブリンゲルはより深く押し込まれ、より強い圧縮を受けるため、液体の流れをより効果的に遮断します。図 2 に示した結果は、繊維状ゲルが出血を減らしたり、腫瘍への血液供給を抑制したりする効果的なプラグとして機能することを示唆しています。

一方、フィブリンは、血栓塞栓症を引き起こす血栓の足場を形成します。血栓塞栓症は、たとえばある種の虚血性脳卒中において、ΔP < ΔPtr で血栓が血管を閉塞する病理学的状態です（図3a）。フレキシブルストランドゲルと比較して、フィブリンミクロゲルの閉じ込め誘発伸長が弱いと、フィブリン濃度、C/Cフィブリノーゲンがより強く増加します。ここで、CとCフィブリノーゲンは、それぞれ閉じ込められたミクロゲルと変形していないミクロゲルのポリマー濃度です。図3bは、SM、MM、およびRMの1 / λr ≈ 4.0でのC / Cフィブリノーゲンの7倍以上の増加を示しています。これは、水の閉じ込めと損失によって引き起こされます（補足図16）。

脳内の脳動脈の閉塞の概略図。 b 閉塞性 SM (赤黒丸)、MM (黒黒四角)、および RM (青黒三角) におけるフィブリン濃度の閉じ込め媒介相対増加。 c 閉じ込められたフィブリンゲルの溶解の研究に使用される実験デザイン。蛍光標識された tPA の TBS 溶液を、メインマイクロチャネルの長軸に直角に配置されたチャネルから 5.6 × 107 μm3/s の流速および追加の圧力差 0.7 Pa で注入しました。 d ΔP = 700 PaでXf = 28μmに配置され、消化を受けた閉塞性MM（D0 = 200μm）のマルチチャンネル顕微鏡画像を結合したもの。垂直破線は、tlys = 0 における後部および前部 MM エッジの元の位置を示します。緑色とピンク色は、それぞれ FITC-Dextran (70 kDa) と AlexaFluor633 標識 tPA に対応します。 e 閉塞RMの相対体積の時間的変化。D0はそれぞれ174μm（青い中空の逆三角形）、199μm（青い三角形）、218μm（青い中空の三角形）で、Xf = 28±1μmに配置されます。 ΔP がそれぞれ 1200、1800、3000 Pa、Q = 1860 ± 70 μm3/s のテーパ状マイクロチャネル領域。挿入図は、マイクロチャネルをブロックしている RM (D0 = 218 μm) を示しています。 f ΔP 400、750、および 1800 Pa、Q 12300 のテーパーマイクロチャネルゾーンの Xf = 32 ± 12 μm に配置された SM、MM、または RM (D0 = 197 ± 3 μm) の相対体積の時間的変化、それぞれ2400、1860μm3/秒。 Xf は、くびれの始まりからの距離によって決定されるミクロゲルの前端の位置です。 V(tlys) と V0 はそれぞれ、溶解したミクロゲルの一時的な体積と摂動されていないミクロゲルの体積です。記号の色は b の色に対応しています。 e、fの黒い矢印は、マイクロゲルがマイクロチャネルを通過する前の最後の時点に対応します。 d、eのスケールバーは100μmです。

閉塞性フィブリンゲルを通過する液体の流れの減少に対する閉じ込めの影響を調べるために、血栓溶解剤である組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）が浸潤したSM、MM、およびRMの溶解を研究しました。図 3c は、溶解実験に使用された実験計画を示しています。 ΔP = 700 Pa (<ΔPtr) および 0.1 mg/mL (フルオレセインイソチオシアネート) FITC-デキストランと混合したトリス緩衝生理食塩水 (TBS) の流速 Q = 2400 μm3/s で、ミクロゲルはテーパー付きマイクロチャネルを閉塞しました。地域。ミクロゲルの前端の位置 Xf によって、くびれの始まり X0 からの距離が決まります。溶解を誘導するために、蛍光標識された tPA の TBS 溶液を、主マイクロチャネルの長軸に対して直角に配置されたチャネルから注入しました。

tPA溶液が閉塞MMに到達すると、後部のミクロゲルの端がぼやけ、tlys = 0の時点でフィブリン消化の開始が示された（図3dおよび補足図18）。線維素溶解中に、色素標識された tPA が MM 内部に蓄積し、フィブリンフィラメントに結合し 26、ミクロゲルのピンク色の強度が徐々に増加しました。 tlys = 60 分では、MM は後部の溶解により収縮しましたが、前端の位置 Xf はわずかに変化しました。 160分後、強く収縮したMMはさらに狭窄部に移動し、tlys = 161分で狭窄部を通過し、マイクロチャネルを通る液体の流れが回復しました（図3dおよび補足図18、右列）。。

図3eは、異なる寸法のフィブリンミクロゲルの元の体積V0で正規化した溶解媒介の体積V(tlys)の時間依存性減少を示しています。 D0が174、199、または218μmのRMを、それぞれ1200、1800、または3000PaのΔPでマイクロチャネルに配置し、Q = 1860±70μm3/sでマイクロチャネルを遮断しました（図3e、挿入図）。。 tPA を供給すると、ミクロゲルは徐々に収縮し、チャネルを通過できるほど小さくなりました。元の直径が大きい RM の臨界容積減少には、より長い溶解時間が必要でした。異なる寸法の RM を通過するフラックスは同様であったため、溶解は同様の速度で起こり、その結果、より大きな RM のより小さな部分が消化され、それらの転座が遅れました。図 3f は、SM、MM、および RM の溶解による V(tlys)/V0 の相対的な減少 (D0 = 197 ± 3 μm) を tlys の関数としてプロットしたものです。各マイクロゲルは、SM、MM、RM に対してそれぞれ 400、750、または 1800 Pa のΔP、および 12300、2400、または 1860 μm3/s の Q でマイクロチャネルに配置されました。 SM に加えられる圧力は RM の圧力の 4.5 分の 1 でしたが、SM を通過する流束は透過性が高いため 6 倍以上強く、ミクロゲルの収縮率は SM から MM、さらに RM へと減少しました。たとえば、tlys = 78 分では、SM は大部分が溶解して移動しましたが、MM と RM は、それぞれ元の体積の 16 % と 20% しか維持していないにもかかわらず、マイクロチャネルを閉塞し続けました。これらの結果は、閉じ込められた繊維状ゲルの対流媒介溶解の重要性を意味しており、フィブリン含量が低いほど血餅の消化が速いという報告と相関しています 27,28。

要約すると、我々の研究は、二軸閉じ込めに対する糸状ゲルの応答機構を実験的および理論的に示しています。閉じ込め下での繊維状ゲルの挙動は、フィラメントの変形エネルギーの強い非対称性 (圧縮すると柔らかく、伸長すると硬い) によって支配され、フィラメントのアスペクト比と曲率によってのみ制御されました。この応答により、同様の剛性を持つ柔軟なストランドのゲルと比較して、狭い毛細管に閉じ込められた繊維状ゲルの伸びが最小限に抑えられ、圧縮の増加に伴う二軸ポアソン比の低下、および転座圧力の低下が生じました。

柔軟で変形可能な粒子の二軸閉じ込めは幅広い技術で使用されているため 29,30,31,32 、我々の発見は新しい繊維材料の開発を刺激します。特に、細い毛細管またはチューブ内に糸状ゲルを二軸閉じ込めると、ゲルの高密度化が起こり、透過性が大幅に低下します。閉塞性繊維状ゲルを介して液体の流れが強く抑制されるため、出血を防止したり、悪性腫瘍への血液供給を減少させたりするためのプラグとしての使用に利点がもたらされます 33,34,35。一方で、閉塞性フィブリンゲルによる液体流束の減少、したがって対流媒介血栓溶解の抑制により、閉塞性血栓のゆっくりとした溶解についての洞察が得られる 27,36,37。私たちのモデルシステムは、二軸閉じ込めに対する繊維状バイオポリマーハイドロゲルの機械的応答の影響の理解を発展させるための最初のステップです。閉塞性フィブリンゲルに血球または血小板を組み込むことは、それらの閉じ込めを介した挙動に影響を与え 38 、より複雑な生物学的に関連するシステムの挙動を解明するための次のステップとなるでしょう。

フィブリンミクロゲルの調製および MF デバイスの製造のための試薬については、補足情報 (補足方法セクション 2 および 4) に記載されています。フィブリンミクロゲルは、フィブリノーゲン、トリス緩衝液およびトロンビンの混合溶液をフローフォーカシングMF装置で乳化し、その後液滴ゲル化することによって調製した。ウシフィブリノーゲン溶液（TBS中60 mg/mL）、トリス緩衝液およびウシトロンビン溶液（10 mM CaCl2溶液中5 U/mL）を、2つの独立して制御されたシリンジポンプ（PhD 200 Harvard Apparatus PHD 2000シリンジポンプ）を使用してMFデバイスに注入しました。、米国）。連続相、ブロック共重合体 PFPE-P(EO-PO)-PFPE を 1 wt% 含む F-オイルを、3 番目のシリンジポンプを使用して MF デバイスに注入しました。 MF デバイスで生成された液滴は、F-オイルの入った 15 mL 遠心管に収集されました。チューブを 37 °C の水浴に 1 時間置き、フィブリンのゲル化を完了させました。ＦＩＴＣ標識フィブリンミクロゲルは、ウシフィブリノーゲンとＦＩＴＣ標識ヒトフィブリノーゲンをそれぞれ３３：１の重量比で混合した混合物から調製した。この手順は、フィブリンミクロゲルの調製に使用した手順と同じでした。

分散液を１８５ｇで２分間遠心分離することによって、ミクロゲルをＦ－オイルからＴＢＳに移した。沈降したミクロゲルを２０重量％パーフルオロオクタノールを混合したＦ－オイルに分散させた後、０．５重量％のＳｐａｎ８０を含むヘキサン、ヘキサン、０．１重量％トリトンＸ水溶液、ＴＢＳに分散させた。最後に、ミクロゲルを 0.01 wt% の Tween 20 を含む TBS に分散し、実験前に 4 °C で約 1 ～ 2 週間保存しました。

MF デバイスの製造については、補足情報 (補足方法セクション 5) で説明されています。典型的な実験では、MF デバイスの上流と下流に接続する貯水池の相対高さによって制御される正の ΔP を使用して、直径 150 < D0 < 270 μm のマイクロゲルをマイクロチャネルに導入しました。マイクロゲルの摂動されていないサイズは、チャネルアットラージ内でイメージングすることによって決定されました。ミクロゲルは狭窄入口の先細ゾーンで停止した。 MATLAB プログラムを使用して、マイクロゲルの前端が 2 分間変化しないときの x 軸に沿ったマイクロゲルの位置を決定しました。 ΔP の段階的な増加に続いて、ミクロゲルは狭窄部に入るまで先細ゾーンに沿って移動しました。狭窄部へのミクロゲルの完全な挿入後、リザーバー間の水位のバランスをとることによってΔP は急速にゼロに減少し、閉塞ミクロゲルは狭窄部内で定常状態に維持された。閉塞性ミクロゲルの長さを、狭窄部に３０分間閉じ込めた後に測定した。

線維素溶解実験の過程で、t-PA および FITC 標識デキストラン溶液が閉塞性ミクロゲルに浸透しました。各液体の流れは、個別チャネルの蛍光イメージングによって監視されました。 AlexaFluor 633標識t-PAはフィブリン線維に付着し、収縮するフィブリンミクロゲルの内部に蓄積しました（補足図18のTRITCチャネル）。 FITC 標識デキストランの溶液は、蓄積することなくミクロゲル中を移動しました。

この研究の結果を裏付けるデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。フィブリンゲルの生のＳＥＭ画像、閉じ込め前後のフィブリンゲルの生のＴＥＭ画像、および図１〜３の基礎となるソースデータ。 2 と 3 はソースデータファイルで提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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YL はオンタリオエンレイソウ奨学金を認めます。 YFL は、Banting Postdoctoral Fellowship プログラム (NSERC Canada) に感謝します。 EP は、NSERC カナダ大学院奨学金 (博士課程) に感謝しています。 EK と AR は、ディスカバリーおよびカナダ研究委員会プログラムを通じた NSERC カナダによるこの研究への財政的支援に感謝します。 AR は、カナダ肺協会からの助成金を認めています。 MR は、国立科学財団 (助成金 EFMA-1830957) および国立衛生研究所 (助成金 P01-HL108808) の財政的支援に感謝しています。

ヤン・リー

現在の住所: 整形外科、ユトレヒト大学医療センター、ユトレヒト大学、Heidelberglaan 100、3584 CX、ユトレヒト、オランダ

ユンフェン・リー

現在の住所: 吉林大学化学科超分子構造材料国家重点研究所、2699 Qianjin Street、Changchun、130012、中国

エリザベス王子

現在の住所: マサチューセッツ工科大学化学科、88 Ames Street、Apartment 306、Cambridge、MA、02142、USA

トロント大学化学工学および応用化学学部、200 College Street、トロント、ON、M5S 3E5、カナダ

ヤン・リー、アルン・ラマチャンドラン、ユージニア・クマチェワ

トロント大学化学科、80 Saint George Street、トロント、ON、M5S 3H6、カナダ

ユンフェン・リー、エリザベス・プリンス、ユージニア・クマチェワ

血栓症およびアテローム性動脈硬化研究所、237 Barton Street East、Hamilton、L8L 2 × 2、ON、カナダ

ジェフリー・I・ワイツ

マクマスター大学生化学・生物医科学部、1280 Main Street West、ハミルトン、オンタリオ州、L8S 4K1、カナダ

ジェフリー・I・ワイツ

マクマスター大学医学部、1200 Main Street West、ハミルトン、ON、L8N 3Z5、カナダ

ジェフリー・I・ワイツ

PN レベデフ物理学研究所、ロシア科学アカデミー、53 Leninskiy Prospekt、モスクワ、119991、ロシア連邦

セルゲイ・パニュコフ

デューク大学機械工学および材料科学学部、ダーラム、ノースカロライナ州、27708、米国

マイケル・ルービンスタイン

デューク大学生物医工学部、ダーラム、ノースカロライナ州、27708、米国

マイケル・ルービンスタイン

デューク大学化学科、ダーラム、ノースカロライナ州、27708、米国

マイケル・ルービンスタイン

デューク大学物理学科、ダーラム、ノースカロライナ州、27708、米国

マイケル・ルービンスタイン

ワールドプライマー化学反応設計発見研究所（WPI-ICReDD）、北海道大学、〒001-0021 北海道札幌市

マイケル・ルービンスタイン

トロント大学生物医工学研究所、164 College Street、トロント、ON、M5S 3G9、カナダ

ユージニア・クマチェワ

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YL、YFL、EP は実験を行いました。 YL は理論モデリングのためのデータ分析を実行しました。 AR、SP、MR は理論モデリングを実行しました。 JW は、EK が研究を監督し、指導した実験結果について議論し、解釈しました。著者全員が原稿に貢献しました。

アルン・ラマチャンドラン、マイケル・ルービンシュタイン、またはユージニア・クマチェワとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jian Ping Gong と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Li, Y.、Li, Y.、Prince, E. 他二軸閉じ込め下の繊維状ヒドロゲル。 Nat Commun 13、3264 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30980-7

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受信日: 2022 年 1 月 25 日

受理日: 2022 年 5 月 19 日

公開日: 2022 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30980-7

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