筋細胞の伸長は転写およびスプライシングの移行と SR タンパク質の変化を誘発します

Communications Biology volume 5、記事番号: 987 (2022) この記事を引用

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この記事に対する著者の訂正は、2022 年 10 月 10 日に公開されました。

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選択的スプライシングは、骨格筋の発達と病理に関与する RNA 処理メカニズムです。 筋疾患はスプライシングの変化とメカノバイオロジーの変化を示し、機械的な力と RNA プロセシングの間の相互関係の研究につながります。 筋細胞を伸張した後、ディープRNAシーケンスを実行しました。 まず、筋肉の機能と転写に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写変化を明らかにしました。 次に、多数の機械感受性遺伝子が、ストレッチに反応して活性化される MAPK 経路の一部であることを観察しました。 第三に、骨格筋細胞を伸ばすと、選択的にスプライスされたカセットエクソンとその包含の割合が増加することを明らかにしました。 第 4 に、セリンとアルギニンに富むタンパク質が他の RNA 結合タンパク質よりも強い転写変化を示し、SRSF4 のリン酸化が機械感受性であることを実証しました。 SRSF4 が機械伝達、転写、スプライシング間のクロストークに寄与する可能性のある機械感受性 RNA 結合タンパク質であることが特定されれば、筋疾患、特に病因が不明な疾患についての新たな洞察が得られる可能性があります。

選択的スプライシングは、タンパク質の多様性を拡張する RNA プロセシング メカニズムであり、高等真核生物では非常に広く普及しており、ヒト遺伝子の 95% 以上が選択的スプライシングを受けています1。 骨格筋では、広範な選択的スプライシング移行が生後に起こり 2、収縮装置の成熟に寄与します 3、4、5、6。 骨格筋は、その発達のために分子機構と機械的特性の両方に依存する複雑な組織です。 筋収縮装置は、サルコメア、横尿細管、およびコスタメアで構成されており、これらは一緒になって、機械伝達として知られるプロセスで、筋細胞を横切って核から細胞膜まで力を伝達します7。 興味深いことに、さまざまな筋疾患では、成人の選択的スプライシング パターンが胎児期に戻り、筋肉の損失、萎縮、および筋肉の機能不全に寄与します 3、4、8、9。 したがって、骨格筋における分子遷移は、組織の適切な発達にとって重要です。

骨格筋は、発達中に分子の転移を受けるだけでなく、機械的な力に反応し、収縮を通じて協調的な力のバーストを生成する必要があります。 筋細胞は、機械的伝達に対して特に感受性が高い10。 周囲の硬さは細胞の伸長と分化を制御し、それが効率的な筋肉の収縮に重要となります11。 健康な人と比較して、筋ジストロフィー患者の筋細胞はより硬いため、適切な収縮が妨げられ、最終的には筋肉の消耗につながると考えられています11、12、13。

個々の選択的スプライシング事象の全体的なミススプライシングまたは誤った調節が、適切な筋肉機能の喪失を引き起こすことが広く実証されている2、3、4、6、14、15。 デュシェンヌ型筋ジストロフィー（スプライシングの調節不全）を患うマウスは、機械感受性シグナル伝達経路に変化を示し、筋肉の物理的変化が分子反応に関連していることを示しています16。 この考えを拡張すると、筋ジストロフィーを患う老化マウスは、スプライススイッチング療法と運動の両方を含む介入に反応して疲労の軽減を示します17。 これらの研究は、筋疾患、スプライシングの誤調節、および筋肉の機械的変化の間の関連性を確立しています。 しかし、機械的力と選択的スプライシングが筋肉の恒常性を維持するためにどのように連携するのか、またそれらが筋疾患の発症にどの程度寄与するのかは不明です。

この研究では、ディープ RNA シーケンス (RNA-seq) を使用して、骨格筋細胞の伸張がグローバルなオルタナティブ スプライシングと遺伝子発現プログラムにどのような影響を与えるかを調査します。 私たちは、機械的ストレッチが、転写、筋細胞分化、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) 経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子に広範な転写変化を誘導することを発見しました。 さらに、ストレッチングはカセットエクソンのスプライシングの変化を促進し、スキッピングよりもエクソンの組み込みを促進します。 この証拠は、RNA 結合タンパク質 (RBP) が、細胞の伸長に応答したスプライシング変化の誘導に役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

シグナル伝達経路に対するストレッチの影響についてはさまざまな研究が行われていますが、私たちの知る限り、ストレッチが骨格筋細胞における遺伝子発現や選択的スプライシングプログラムにどのような影響を与えるかを定義するための、公平で包括的なアプローチを利用した研究はありません。 この知識のギャップに対処するために、Flexcell システムを利用して筋肉細胞に機械的な力をさまざまな時間 (1 時間、3 時間、6 時間) 加えてから、詳細な RNA-seq 研究を実行しました。

私たちは、ストレッチがこれらの段階に特有の転写および転写後プログラムにどのような影響を与えるかを判断するために、筋細胞分化（筋形成）の 2 つの異なる段階で研究を行うことを選択しました。 発達中、筋肉は成人の適切な収縮に必要な細胞内構造を成熟させます。 筋芽細胞は、初期の筋肉発達または疾患により萎縮した筋肉を模倣する未分化の筋肉細胞です。 一方、分化した筋肉細胞は、正常な成人の筋肉をよりよく模倣します。 注目すべきことに、培養下でのC2C12筋芽細胞の多核筋管への分化は、生体内での骨格筋発達中に観察される転写および転写後の移行を再現しており2,18,19、これらの細胞は機械的伝達を理解するための優れた細胞培養モデルとして確立されています18,19,20。 未分化細胞 (筋芽細胞) と分化 4 日後の細胞 (分化細胞) を伸張しました。

ほとんどの細胞伸張システムは、機械的張力を一方向にのみ適用できますが、これは骨格筋収縮の正確なモデルではありません。 収縮中、骨格筋は横方向と縦方向の両方に力を伝達することにより、筋線維全体に力を生成します21。 ここで利用した Flexcell システムは、生体内骨格筋力伝達の広く受け入れられているモデルである周期的等二軸方式で細胞を伸長するため、ユニークでした 22,23,24。 細胞が伸長される時間は、以前の研究 25 に基づいて選択され、伸長に対する急性反応 (1 時間)、中間反応 (3 時間)、および持続的反応 (6 時間) を調査しました。 私たちのシステムで可能な最大量 (16%) で細胞を引き伸ばしました。これは、細胞がプレーティングされた柔軟な膜にかかる圧力 -69.5 (kPa) およびひずみ 0.16 に相当します。

シーケンス後、サンプルあたり 6,300 万〜 1 億 300 万のリードペアの範囲が得られ、そのうちの 90% 以上が mm10 マウスゲノムにマッピングされていました (補足データ 1)。 高いマッピング率は、シーケンス データの適切な品質を示しています。 我々は最初に、いくつかの筋形成マーカーが筋芽細胞サンプルでは発現されず、分化した細胞では高度に誘導されたことを確認しました（補足図1）。 次に、主成分分析 (PCA) を実行し、筋芽細胞 (図 1a) と分化細胞 (図 1b) の両方の遺伝子発現に基づいてサンプルをクラスター化しました。 伸長されていない筋芽細胞は、1時間伸長サンプルと6時間伸長サンプルの2つの異なるサブクラスターとともに分離されました（図1a、それぞれ濃い緑色と濃い青色）。 3 時間伸長した筋芽細胞は、伸長していないサンプルの近くに分離しました (図 1a、濃い紫色)。 分化した細胞では、伸長されていないサンプルはすべて一緒に分離されており、異なる伸長時点で 3 つの異なるグループが観察され、伸長の時間の変化により異なる遺伝子発現変化が生じることが示されました (図 1b、濃い緑色、濃い紫色、濃い色)青）。 1 時間伸張したサンプルの 1 つは、他の複製サンプルと厳密には分離しませんでしたが、他の時点のサンプルよりも類似したままでした。 このサンプルは他の品質管理に合格したため、結果に記載されている分析のすべてのサンプルに含まれていました。 このサンプルを除いた事後テストが実行されましたが、研究の結論は変わりませんでした。

a、b 筋芽細胞と分化細胞の主成分分析 (PCA) プロット。 CD。 筋芽細胞および分化細胞を 1 時間、3 時間、または 6 時間伸長すると、全体的な遺伝子発現が変化します。 遺伝子発現の変化は、伸張したサンプルと伸張していないサンプルを比較することによって計算されました。 調整されたp値<0.05および倍率変化が>1.50(上方制御、上方)または倍率変化<-1.50(下方制御、下方)の場合、遺伝子は示差的に発現するとみなした。 e、f。 qPCR アッセイによって測定された遺伝子発現変化 (log2foldchange として表される) と、筋芽細胞および分化細胞における RNA-seq 研究で観察された変化の間の相関プロット。 相関プロットに含まれる個々の遺伝子の qPCR グラフを補足図 2 (筋芽細胞) および補足図 3 (分化細胞) に示します。

筋芽細胞では、非伸長細胞と比較した場合、1時間および3時間の伸長後にそれぞれ151個および134個の遺伝子がダウンレギュレートされましたが、これらの時点でアップレギュレートされた遺伝子はわずか数個（それぞれ37個および46個）でした（図1c） 、 左）。 6時間の伸長後、伸長していないサンプルと比較して158個の遺伝子が上方制御されているのに対し、102個の遺伝子が下方制御されていることがわかりました（図1c、右）。 分化した細胞では、伸長していないサンプルと比較した場合、1 時間および 3 時間の伸長に応答して、それぞれ 54 個および 98 個の遺伝子がダウンレギュレートされました。 伸長された分化細胞では、いくつかの遺伝子（44 および 107）が、それぞれ 1 時間および 3 時間の伸長後に上方制御されました（図 1d、左）。 6時間の伸長後、伸長していないサンプルと比較して188個の下方制御された遺伝子が見つかりましたが、67個の遺伝子が上方制御されていました（図1d、右）。 全体として、筋芽細胞と分化細胞の両方において、1 時間と 3 時間のストレッチは、6 時間のストレッチよりも同様の遺伝子発現変化を引き起こしました。

筋芽細胞（補足図2）および分化細胞（補足図3）において、定量的リアルタイムPCR（qPCR）を使用して、ストレッチに応答した遺伝子発現の変化を検証しました。 我々は、上方制御された遺伝子については倍率変化が1.5を超え、下方制御された遺伝子については倍率変化が-1.5未満であり、調整されたp値が<0.05である検証用の遺伝子を選択した。 筋芽細胞と分化細胞の両方でアッセイされた遺伝子のうち 2 つは、結合組織増殖因子 (Ctgf) とシステインに富む血管新生誘導因子 61 (Cyr61) で、どちらも十分に確立された機械感受性遺伝子です 26、27、28。 Ctgf および Cyr61 mRNA は、筋芽細胞では 1 時間の伸長後、分化細胞では 1 時間および 3 時間の伸長後に上方制御され、細胞伸長が成功したことを示しました（補足図 2、3）。 6時間のストレッチ後、CtgfおよびCyr61 mRNAは筋芽細胞でも分化細胞でも上方制御されず（補足図2、3）、これは細胞が以前に報告されている長い機械的刺激に慣れていることを示唆しています28。

相関プロットを作成して、RNA-seq 研究で検出された mRNA 発現変化を qPCR アッセイで測定された変化と比較しました。 筋芽細胞（ピアソン = 0.97、図1e）と分化細胞（ピアソン = 0.94、図1f）の両方で、2つのアプローチの間に強い相関関係が観察されました。 この堅牢な検証により、当社の RNA-seq データは高品質であることが確立されています。

次に、ストレッチの異なる時点で上方制御または下方制御された遺伝子が機能的に関連しているかどうかを尋ねました。 この質問に答えるために、Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) を使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行しました。 筋芽細胞の場合、1時間および3時間のストレッチに反応した遺伝子は、転写制御と筋細胞分化に関与するタンパク質をコードしていましたが、タンパク質の折り畳みに関連するカテゴリーは、より長い時間のストレッチ（6時間）に反応した遺伝子については明らかでした（補足図） .4a)。 分化した細胞では、ストレッチに応答する遺伝子は、筋肉機能、転写、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）シグナル伝達経路（1時間）およびステロイド恒常性（3時間および6時間）に関与するタンパク質をコード化しました（補足図4b）。 。 筋芽細胞と分化した細胞の両方において、より短い伸張時間に応答する遺伝子は、転写調節と筋肉分化において機能するタンパク質をコードする傾向があった。 全体として、我々のデータは、骨格筋細胞の機械的伸張が、細胞分化と転写制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子における明確で全体的なmRNA発現変化を誘導することを公平な方法で実証している。

機械的な力は細胞の原形質膜に影響を与えるため、我々は伸張に応答して活性化される特定の細胞内シグナル伝達経路を特定することに興味を持っていました。 これを調査するために、分化した細胞で 1 時間または 3 時間の伸張に応答する遺伝子に対して DAVID 経路解析を実行しました。 1 時間のストレッチ後、MAPK カスケード、上皮成長因子受容体ファミリー (ErBβ)、ヤヌスキナーゼシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子 (JAK/STAT) 経路、腫瘍壊死因子 (TNF) などの経路で応答遺伝子が濃縮されました。 ）シグナリング（図2a）。 3 時間伸長したサンプルではほとんど経路が濃縮されませんでした。 興味深いことに、1 時間の伸長後に上方制御された多数の遺伝子は、MAPK、ErBβ、および JAK/STAT 軸の交差点にある細胞外シグナル関連キナーゼ (ERK1/2) カスケードの一部であるタンパク質をコードしていました。 ERK1 / 2 リン酸化は C2C12 細胞分化中に大幅に減少しましたが、総 ERK1 / 2 タンパク質レベルは変化しませんでした（補足図 5）。 興味深いことに、ERK1 / 2は、分化した細胞において1時間および3時間の細胞伸張に応答して有意にリン酸化されました（図2b）。 ERK1/2 は、マウスおよびラットの骨格筋および C2C12 細胞における伸張刺激に応答してリン酸化されることが以前に実証されており、したがって、我々のデータは以前の研究を裏付けるものである 29,30,31。

a 分化した細胞の伸長に応答して差次的に発現される遺伝子の経路解析は、DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) を使用して実行されました。 赤い線は、p 値 <0.05 を示します。 b 分化した筋細胞を 1 時間または 3 時間ストレッチしました。 ウェスタンブロットアッセイを実行し、総ERK1/2およびリン酸化ERK1/2（p-ERK1/2）レベルを調べるためにデンシトメトリーによって定量した。 結果は平均±SEM、N = 3、*p < 0.05、ウェルチの T 検定として示されています。 c RNA-seq データを使用した、ERK1/2 に関連するシグナル伝達経路に関与するタンパク質をコードするさまざまな遺伝子の mRNA 発現変化 (分化細胞)。 倍率変化は、伸長サンプルと非伸長サンプル間の比率として定義されました。 1 を超える値は上方制御された遺伝子を示し、1 未満の値は下方制御された遺伝子を示します。 d MAPK 経路がどのように活性化されるかを説明するために、細胞の伸張によって活性化される遺伝子を描いた漫画。 no: 伸長されていないサンプル。 s: 伸長サンプル。

MAPK シグナル伝達に対するストレッチの影響をさらに定義するために、RNA-seq データを使用してさまざまな MAPK ターゲットの活性化を調べました。 この経路の多くの遺伝子は、1時間の細胞伸長後に上方制御され、3時間の伸長後にわずかに上方制御されました（図2c）。 さらに、これらの標的のいくつかをqPCRアッセイで検証したところ、有意な上方制御が確認されました（補足図3、MycおよびCtgf）。 まとめると、この証拠は、短いストレッチ（1時間）がMAPK軸を活性化し、シグナル伝達および他の遺伝子の転写活性化で機能するタンパク質をコードする遺伝子の転写を誘導すると結論づけました（図2d）。

ERK1/2 リン酸化は機械感受性であるため、我々はこの経路が伸長時の遺伝子転写の活性化に役割を果たしているかどうかを判断することを目的としました。 これを行うために、十分に確立された ERK1/2 リン酸化阻害剤 (U0126) を使用し、分化した細胞を 1 時間伸長しました (阻害剤の有無にかかわらず)。 最も強いERK1/2リン酸化が1時間の伸長後に起こったため、この伸長時間を選択しました（図2b）。 まず、U0126で処理した後、伸長していない細胞と伸長した細胞の両方でERK1 / 2リン酸化が完全に阻害されたことを確認しました（図3a）。 次に、MAPK 経路の一部であるいくつかの機械感受性遺伝子の mRNA 発現レベルをアッセイしました。 これらの遺伝子のいくつかでは、U0126は伸長に対する応答を廃止し（図3b、Nr4a1、Atf3、およびCcl2）、ERK1 / 2が伸長時のそれらの活性化に役割を果たしていることが示されました。 他のいくつかの遺伝子では、U0126の存在下で伸長に対する応答が部分的に消失し（図3b、Ctgf、Cyr61、Fos、Myc、およびEreg）、これはERK1 / 2が伸長時のこれらの標的の唯一の活性化因子ではない可能性を示唆しています、しかし活性化を維持するのに役立つかもしれません。 要約すると、ERK1/2 リン酸化の阻害はいくつかの機械感受性遺伝子に影響を与え、分化した細胞の伸長応答におけるこの経路の役割を示しています。

a 分化した筋細胞を ERK1/2 リン酸化阻害剤 U0126 で処理し、1 時間ストレッチしました。 ウェスタンブロットアッセイを実行し、総ERK1/2およびリン酸化ERK1/2（p-ERK1/2）レベルを調べるためにデンシトメトリーによって定量した。 b qPCR アッセイを実行して定量化し、8 つの機械感受性遺伝子の mRNA 発現変化を調べました。 結果は平均±SEM、N = 3として示されています。 *p < 0.05、ダネットの事後多重比較検定による一元配置分散分析。

RNA のプロセシングは、転写速度、温度、細胞ストレス、その他の環境要因を含む複数の要因によって制御されます 32、33、34。 したがって、我々は、機械的ストレッチングが骨格筋細胞の選択的スプライシング変化を誘発するという仮説を立てました。

伸長に反応した選択的にスプライスされたイベントの分布を調べるために、Mixture of Isoforms (MISO) ソフトウェア 35 を利用しました。 MISO を使用すると、エクソン レベルでの選択的スプライシング パターンを正確に決定できます。 我々は、スプライスイン率の変化 (ΔPSI) を、伸長条件での PSI と非伸長サンプルの PSI (PSIstretch – PSIno 伸長) の差として定義しました 36。 Wilcox の p 値 ≤ 0.05 および | の場合、イベントは差次的にスプライスされていると見なされます。 ΔPSI | > 10. 筋芽細胞では、細胞が長期間引き伸ばされるにつれて、スプライシングイベントの総数が増加することが観察されました (図 4a、左)。 一方、分化した細胞では、スプライシングイベントの総数は1時間から3時間に増加し、3時間から6時間にわずかに減少しました（図4a、右）。

a RNA-seq 実験によって特定された、筋芽細胞 (左) および分化細胞 (右) の 1 時間、3 時間、および 6 時間の伸張後の選択的スプライシング イベントの数。 b、c 筋芽細胞および分化細胞の伸長に応じた選択的スプライシング変化の主成分分析（PCA）プロット。 d、e. RNA-seq 研究から得られた ΔPSI 値と、筋芽細胞および分化細胞における RT-PCR 実験から得られた ΔPSI 値の相関プロット。 筋芽細胞では N = 4、分化細胞では N = 4 ～ 5。 相関プロットに含まれるデータを生成する RT-PCR ゲルを補足図 6 (筋芽細胞) および補足図 7 (分化細胞) に示します。 | の場合、代替領域は差分スプライスされていると見なされます。 ΔPSI | 伸長サンプルと非伸長サンプルの間で > 10。 ΔPSI は、伸長サンプルの PSI と伸長していない対照の PSI の差として定義されました。 PSI パーセントが接続されています。

PCA 分析により、伸長回数の増加に伴う選択的スプライシング イベント間の相関関係が明らかになりました。 筋芽細胞については、1時間、3時間、および6時間伸張したサンプル（図4b、それぞれ濃い緑色、濃い紫色、および濃い青色）で明確な分離と、伸長していないサンプルの分離が観察されました。 同様に、伸長していない分化細胞は一緒に分離され、1時間、3時間、および6時間伸長したサンプルは明確なグループを示しました（図4c、それぞれ濃い緑色、濃い紫、および濃い青色）。 これらのデータから、伸張は各時点で選択的スプライシングに明確な変化を引き起こすとの結論に至りました。

伸張に応答してRNA-seqによって検出されたスプライシング遷移を検証するために、筋芽細胞の12のカセットエクソン（補足図6）および分化細胞の11のカセットエクソン（補足図7）の逆転写PCR（RT-PCR）分析を実行しました。 ）。 これらのイベントの一部は、RNA-seq データにより、異なる時点でストレッチに反応することが明らかになったので、複数の時点にわたってアッセイされました。 RNA-seqからのΔPSI値とRT-PCR実験からのΔPSI値の間に強い相関関係（筋芽細胞でピアソン=0.82、分化細胞でピアソン=0.84）が観察されました（図4d、e）。

全体として、我々は、RNA-seq 研究により再現性が高く堅牢なデータが得られ、筋細胞では多くのスプライシング事象が機械感受性であると結論付けました。

カセットエクソン、相互排他的エクソン、保持イントロン、選択的3'スプライス部位、選択的5'スプライス部位など、さまざまなタイプのスプライシングイベントが存在します（図5a）。 したがって、より一般的なスプライシング イベントの種類があるかどうか、またスプライシング イベントの種類の分布が伸長時間の経過とともにどの程度変化するかを調べました。 まず、すべての時点でスプライシング イベントの 44% 以上がカセット エクソンであることが観察されました (図 5b)。 第二に、細胞が伸長するにつれて、選択的にスプライシングされるカセットエクソンの割合が時間の経過とともに増加する一方、保持されたイントロンの割合が減少することがわかりました（分化細胞における3時間から6時間への移行を除く）（図5b）。 カセット エクソンは最も一般的なタイプのスプライシング イベントであるため、残りの分析はカセット エクソンに焦点を当てました。

さまざまなタイプのスプライシング イベントを示す概略図。 b 筋芽細胞（上）および分化細胞（下）におけるスプライシングイベントのタイプに応じた分布。 括弧内の数字はスプライシング イベントの数を示します。 c 筋芽細胞（上）と分化細胞（下）のカセットエクソン長の密度プロット。 カセットエクソン長のモードは各プロットの隣に示されています。 d 筋芽細胞 (上) および分化細胞 (下) における 3 で割り切れない (紫) または 3 で割り切れる (青) カセット エクソンの割合。 括弧内の数字はスプライシング イベントの数を示します。 e 伸張時に選択的にスプライスされた領域のより多くの包含（ΔPSI > 10、青）またはより多くの除外（ΔPSI < -10、赤）を受けたスプライシングイベントの割合。 括弧内の数字はスプライシング イベントの数を示します。 ΔPSI は、伸長サンプルの PSI と伸長していない対照の PSI の差として定義されました。 PSI パーセントが接続されています。

次に、伸張がカセットエクソン長の分布およびモードの変化を誘発するかどうかを調べました。 分化した細胞よりも筋芽細胞の方がモードのばらつきが大きかった。 ただし、3 つの時点すべてにわたって、筋芽細胞と分化細胞の両方でカセット エクソン長の同様の分布があり (図 5c)、カセット エクソンの長さが伸縮の影響を受けないことを示唆しています。

3 で割り切れるカセット エクソンは、タンパク質配列にペプチドを追加したり、終止コドンを追加したりする可能性があります。 一方、3 で割り切れないカセット エクソンは読み取りフレームを中断する可能性があり、多くの場合、切断されたタンパク質や異なる C 末端を持つタンパク質が生成されます。 このようにして、伸長に敏感で、3 で割り切れるか割り切れないエクソンの割合を決定しました。 筋芽細胞では、1時間のストレッチに反応したカセットエクソンの48％は3で割り切れ、3時間または6時間のストレッチに反応したエクソンの61％および50％もそれぞれ3で割り切れました（図5d、図5d、上）。 これは、筋芽細胞が 3 時間の伸長後に示す切断タンパク質またはフレームシフトの可能性がわずかに少ないタンパク質を示す可能性があることを示しています。 逆に、分化した細胞では、3 つのすべての時点で、伸長に敏感で 3 で割り切れるカセット エクソンの割合が同様でした: 48% (1 時間)、45% (3 時間)、および 43% (6 時間) (図 5d) 、 底）。

次に、ストレッチにより、交互にスプライスされた領域のスキップが増加するのか、それとも挿入が増加するのかを尋ねました。 筋芽細胞では、ΔPSI > 10（伸長により封入が誘発される）のイベントの割合が伸長時間とともに増加します（補足図8a、左）。 分化した細胞では、同じ方向のより劇的な傾向が観察されました（補足図8a、右）。 分析のほとんどをカセットエクソンに焦点を当てたので、ストレッチが特にカセットエクソンのスキッピングまたはインクルージョンをさらに誘発するかどうかも判断しました。 筋芽細胞では、ΔPSI <-10（伸長により排除が誘導される）を持つカセットエクソンの割合は、伸長時間の経過とともにわずかに増加します（図5e、上）。 分化した細胞では、伸張時間が長くなり、カセットエクソンのより多くの包含が誘導されるという逆の傾向が観察されました（図5e、下）。

次に、細胞伸張によって調節される選択的にスプライシングされたカセットエクソンを含む遺伝子が機能的に関連しているかどうかを決定するためにGO分析を実行しました。 筋芽細胞では、転写制御（1時間、3時間、6時間）およびDNA損傷、リン酸化（3時間および6時間）に関連するカテゴリーが豊富でした（補足図8b）。 分化した細胞において、伸長時に選択的にスプライシングされた遺伝子を分析したところ、転写制御 (1 時間および 6 時間)、リン酸化 (1 時間、3 時間、6 時間)、および DNA 損傷 (6 時間) に関連するカテゴリーの濃縮が観察されました。 ）（補足図8c）。 筋芽細胞のすべての時点および分化細胞の 6 時間の伸長に応答したカセット エクソンを含む遺伝子は、DNA 損傷カテゴリーについて濃縮されました。 これは、分化した細胞を長期間引き伸ばすと損傷が生じる可能性があることを示唆しています。

筋芽細胞と分化細胞は異なる機械的環境を経験しますが、一部の遺伝子は分化状態に関係なく機械感受性があるのではないかという仮説を立てました。 これを調べるために、伸長後の各時点で、筋芽細胞と分化細胞の間で、転写（遺伝子発現）レベルとスプライシングレベルの両方で機械感受性遺伝子をオーバーラップさせました。 1 時間のストレッチ後、筋芽細胞と分化した細胞は多数の機械感受性遺伝子 (57 遺伝子) を共有していることがわかりました。 この重複は、細胞が長く伸長されるにつれて減少しました（3時間の伸長では37個の遺伝子、6時間の伸長では43個の遺伝子）（補足図9a）。 全体として、どの時点においても、筋芽細胞と分化した細胞の間で重複する、選択的にスプライシングされた遺伝子はほとんどありませんでした (12 ～ 19 遺伝子)。 1時間のストレッチ後の筋芽細胞と分化細胞の両方の機械感受性遺伝子をさらに調べると、それらのいくつかがMAPK経路に関与していることが明らかになりました（補足図9b、緑色）。 Nr4a1、Atf3、Ctgf、Fos は ERK1/2 リン酸化阻害に応答することが確認され、実際に ERK1/2 が伸長に対する応答の制御に関与していることが示されました（図 3b）。

これまでの研究では、スプライシングの変化により、全体的な遺伝子発現レベルの変化の変動とは対照的に、異なるタンパク質アイソフォームの発現が生じることが実証されています 37,38,39。 これを調べるために、機械感受性遺伝子を転写（遺伝子発現）レベルで、各時点での伸長に応答して選択的スプライシングパターンを変化させる遺伝子と重ね合わせました（補足図10）。 我々は、転写が変化した機械感受性遺伝子とスプライシングパターンを変化させる機械感受性遺伝子との間に最小限の重複があることを発見した。 したがって、細胞の伸長による転写の変化とスプライシングの変化は、異なる細胞プロセスに関与しており、互いに独立しています。

ストレッチ時間を長くすると、分化した細胞でより多くのエクソンインクルージョンが誘導されるため、特定のスプライシング因子の発現、翻訳、または活性の変化がエクソンインクルージョンの促進に関与しているのではないかという仮説を立てました。 これを評価するために、RNA-seq データを使用して、分化した筋細胞の伸長が RBP の mRNA 発現レベルに及ぼす影響を測定しました。 全体的に、より顕著な変化を示す RBP のグループは、セリンおよびアルギニンに富む (SR) タンパク質であることが観察されました。 真核生物には、選択的スプライシングと遺伝子発現を調節する 12 個の SR タンパク質（SRSF1 ～ SRSF12 と名付けられています）が存在します 40。 これらのタンパク質は細胞内で数多くの機能を持っていますが、最も顕著にスプライシング反応に関与しています 41,42。

私たちの研究では、SRSF2、SRSF5、およびSRSF6が伸長後に強いmRNA変化を示すことが観察されました（図6a）。 対照的に、CUGBP Elav 様ファミリーメンバー (CELF) タンパク質、筋盲様スプライシング調節因子 (MBNL) タンパク質、不均一核リボ核粒子 (HNRNP) タンパク質、ポリピリミジントラクト結合タンパク質 1 (PTBP1) などの他の RBP は筋細胞で広く発現されています。地震（QKI）、およびRNA結合fox-1ホモログ2（RBFOX2）は、細胞の伸張に対して、たとえあったとしても最小限に反応しました（図6a）。

a 分化した細胞の細胞伸長に応じて、さまざまな RNA 結合タンパク質 (RBP) の遺伝子発現が変化します。 倍率変化は、伸長サンプルと非伸長サンプル間の比率として定義されました。 1 を超える値は上方制御された遺伝子を示し、1 未満の値は下方制御された遺伝子を示します。 b 転写レベルで SR タンパク質の過剰発現に応答する遺伝子 43 と細胞の伸長に応答する遺伝子の間の重複を示す円グラフ。 括弧内の数字は遺伝子の数を示します。 c SRタンパク質の過剰発現43に応答する代替カセットエクソンを持つ遺伝子と、細胞伸長（スプライシングレベル）に応答する代替カセットエクソンを持つ遺伝子の間の重複を示す円グラフ。 括弧内の数字は遺伝子の数を示します。

SR タンパク質はリン酸化によって活性化され 40、SR タンパク質のリン酸化は機械的伝達に寄与している可能性があります。 しかし、私たちの知る限り、この仮説を検証した研究はありません。 したがって、我々は、（転写またはスプライシングレベルで）伸長に応答する遺伝子のいずれかが SR ファミリータンパク質の既知の標的であるかどうかを調査しました。 これを調べるために、MCF-10A 細胞における SRSF2、SRSF4、SRSF6、または SRSF9 の過剰発現に応答する遺伝子とスプライシング事象を同定した以前の RNA-seq 研究を使用しました 43。 SRタンパク質の過剰発現（転写レベルおよびスプライシングレベル）に応答する遺伝子と、分化した筋肉細胞で機械感受性を示す遺伝子（すべての時点）の間の重複を決定しました。 伸長に応答した遺伝子の約18％はSRSF4過剰発現に応答した遺伝子と重複していましたが、他のSRタンパク質ではその割合は低かった（図6b）。 興味深いことに、スプライシングレベル（カセットエクソン）の伸張応答性遺伝子の20％および21％が、それぞれSRSF4またはSRSF6の過剰発現に応答する遺伝子と重複しました（図6c）。 全体として、これは、細胞の伸長が転写および転写後の変化の両方を誘導し、それが我々のシステムにおいてSRSF4によって調節される可能性があることを示唆している。

SR タンパク質の活性化はリン酸化によって起こるため、我々は、ストレッチが SR タンパク質のリン酸化変化を誘導する可能性があると仮説を立てました。 私たちは、いくつかの SR タンパク質を探索し、分化した筋細胞におけるリン酸化状態を調査しました。 上で説明したように、6時間のストレッチに反応したスプライシングの変化は、DNA損傷応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子で発生しました（補足図8c）。これは、長時間のストレッチがストレス応答を誘発する可能性があり、長すぎる可能性があることを示唆しています。私たちの細胞に刺激を与えます。 さらに、Ctgf および Cyr61 は、分化した細胞において 6 時間後に有意な上方制御を示さず、細胞が伸張刺激に適応したことを示しています。 したがって、1 時間と 3 時間の時点のみを分析することにしました。

いくつかの SR タンパク質の総タンパク質レベルとそれらのリン酸化の程度をウェスタンブロッティングによって評価しました。 興味深いことに、Srsf4 mRNA発現は伸長に応答しなかったにもかかわらず（図6a）、伸長細胞と非伸長細胞の間でリン酸化SRSF4レベルの違いが観察されました（図7a）。 1時間の伸張後、SRSF4総タンパク質はわずかに上方制御されましたが、そのリン酸化レベルは大幅に減少しました（図7a）。 SRSF4総タンパク質は、3時間のストレッチに応答してわずかに上方制御され、これには対応するリン酸化の増加が伴いました（図7a）。 ストレッチによってmRNAレベルの変化が誘導されたにもかかわらず、ストレッチ後にSRSF5の総タンパク質またはリン酸化に変化は観察されませんでした（図7b）。 Srsf6 mRNA発現およびSRSF6総タンパク質は、3時間の伸張後にわずかに上方制御され、これにはリン酸化レベルの有意な増加が伴いました（図7c）。

分化した筋細胞を 1 時間または 3 時間伸長し、ウェスタンブロットアッセイを実行してデンシトメトリーで定量し、SRSF4 (a)、SRSF5 (b)、および SRSF6 (c) の総レベルとリン酸化レベルを調べました。 no: 伸長されていないサンプル。 s: 伸長サンプル。 d 図6cに示すSRSF4円グラフの一部の重複遺伝子とスプライシングイベントは、機械感受性の標的とSRSF4によって調節される標的がMAPKシグナル伝達カスケードにおいてどのように役割を果たすかを示す、1時間および3時間のストレッチタイムポイントの漫画で描かれています。 ATF3 活性化転写因子 3、AREG アンフィレグリン、BMF Bcl2 修飾因子、CYR61 システインリッチ血管新生誘導因子 61、CYP1A1 シトクロム p450 ファミリー 1 サブファミリー A メンバー 1、CTGF 結合組織増殖因子、DDR1 ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ 1、DUSP1 二重特異性ホスファターゼ1、DUSP5 二重特異性ホスファターゼ 5、EGFR 上皮成長因子受容体、ERK 細胞外シグナル制御キナーゼ、EREG エピレグリン、FGFR3 線維芽細胞成長因子受容体 3、FHL2 4.5 LIM ドメイン 2、FOS Fos 癌原遺伝子 AP-1 転写因子サブユニット、FOSL1 FOS 様 1 AP-1 転写因子サブユニット、GPR3 G タンパク質共役受容体 3、GPR39 G タンパク質共役受容体 39、HBEGF ヘパリン結合 EGF 様成長因子、LATS 大型腫瘍抑制キナーゼ 1、JNK c-Jun N-ターミナルキナーゼ、MADD MAP キナーゼ活性化デスドメイン、MEIS meis ホメオボックス 1、MYC MYC 癌原遺伝子、NPR3 ナトリウム利尿ペプチド受容体 3、PBX3 PBX ホメオボックス 3、PIT1 下垂体転写因子 1、PLAU プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼ、PTPN22 プロテインチロシンホスファターゼ非受容体タイプ 22、P38 p38 マイトジェン活性化プロテイン キナーゼ、G タンパク質シグナル伝達の RGS2 制御因子 2、SQLE スクアレン エポキシダーゼ、TEAD4 TEA ドメイン転写因子 4、TIMP3 TIMP メタロペプチダーゼ阻害剤 3、YAP はい関連タンパク質。 結果は平均値 ± SEM、N = 4 (a)、N = 4 (b)、N = 4 (c) *p < 0.05、Welch の T 検定として示されています。

したがって、SRSF4 リン酸化は 1 時間のストレッチ後に機械感受性があるようですが、ストレッチ期間を長くすると (3 時間)、SRSF4 総タンパク質が増加し、同時にそのリン酸化も増加しました。 私たちは、細胞が伸長したときにSRSF4が制御する潜在的な転写プログラムおよび転写後プログラムを決定することに興味がありました。 これを調べるために、SRSF4 の過剰発現 43 および細胞伸張 (1 時間および 3 時間) に応答した重複遺伝子とスプライシング イベントを分析しました (図 7d)。 我々は、これらの重複遺伝子のいくつかがMAPKシグナル伝達カスケードに関連するタンパク質をコードしていることを観察しました（図7d）。 この証拠により、我々は、筋肉細胞においてSRSF4が、MAPK経路の伸長に応答して転写および転写後プログラムの制御を助ける機械感受性RBPとして機能する可能性があると提案するに至った。

さまざまなグループが、さまざまな伸長振幅とさまざまな時間間隔で筋細胞を伸長させました。25 でレビューされています。 これらの研究は矛盾した結論を提示しており、ストレッチが筋細胞の増殖を誘導すると主張するものもあれば、ストレッチが筋細胞の分化を促進すると主張するものもある25。 我々は、筋芽細胞における特定の分化転写因子の上方制御と下方制御の両方を観察しました。 ミオゲニンは筋形成の主要な原動力であり、ストレッチ後に下方制御されました。 FOS 癌原遺伝子はミオゲニンの負の制御因子であり、1 時間の細胞伸張後に強く上方制御されました。 この上方制御は、FOS がミオゲニン発現を下方制御して筋細胞の分化を妨げることを示唆しています。 逆に、転写因子早期成長応答 1 (EGR1) はミオゲニン 44 の正の制御因子であり、我々の研究では伸長後に Egr1 mRNA が上方制御されました。 Egr1 mRNAは伸張時に上方制御され、対応するミオゲニン発現の増加は見られないため、これは、FOSがミオゲニン発現を下方制御して、細胞伸張に応答した筋芽細胞の分化を妨げることを示唆しています。

これまでの研究では、筋芽細胞の不均一性が確立されており、これが機械的刺激に対する細胞のさまざまな反応に寄与しているという仮説が立てられています 25,45。 増殖および分化促進転写因子の両方の変化が観察されたため、我々のデータはこの仮説と一致しており、異種筋芽細胞が機械的伸長に対して複雑な応答を生成する可能性があることを示しています。 骨格筋が機械的刺激を受けると、衛星細胞の活性化によって再生がより効果的に起こります46。 したがって、細胞の不均一性が筋芽細胞の伸張に応答する能力に影響を与えるという事実は、筋肉組織の再生能力に影響を与える可能性があります47。

分化した細胞を短期間ストレッチすると、筋肉分化遺伝子といくつかの増殖関連遺伝子の上方制御が誘導されました。 細胞を増殖または分化させる筋形成中の転写プログラムには微妙なバランスがあるため、細胞の増殖と分化に関与するタンパク質は重複することがよくあります48。 興味深いことに、伸長時間の増加によってより大きな変化が引き起こされるのとは対照的に、分化した細胞は、伸長の各時点で、機能的に関連する遺伝子の異なるグループでmRNAの変化を示しました。 これは、筋肉細胞が機械的刺激に適応する際に遺伝子の再プログラミングを受けることを示しています。 これは、骨格筋線維を繰り返し伸張させると、機械的刺激に応じた適応メカニズムとして遺伝子発現プログラムが変化し、線維の種類が変化するという以前の研究と一致しています49。 ストレッチに対する筋細胞の適応は、さまざまなシグナル伝達経路を介して起こります50。これは、全体的により類似した転写遷移を共有する 3 時間および 6 時間のストレッチと比較して、分化した細胞において 1 時間のストレッチの後により独特な遺伝子発現変化が存在する理由の一部を説明する可能性があります。

筋芽細胞には独特の機械的状況があるため、筋芽細胞と分化細胞を直接比較しないことを選択しましたが、興味深いことに、いくつかの機械感受性遺伝子が筋芽細胞と分化細胞の両方の個々の時点で重複していました。 これは、転写レベルおよびスプライシングレベルのいくつかの機械感受性遺伝子が、分化状態に関係なく機械力に同様に応答することを示唆しており、骨格筋における機械伝達を調査する将来の実験の強力な候補となる可能性があります。

MAPK 経路はマウスおよびラットの系で機械感受性であることが知られています 29,30,31 が、この活性化を支配する分子機構とその機能的意味はまだ不明です。 伸長後に上方制御された遺伝子のいくつかはMAPKカスケードの下流標的であり、その他はMAPKの上流活性化因子であることを観察しました。これは、経路の一貫した活性化を促進する潜在的な正のフィードバックループを示しています。 さらに、機械感受性遺伝子の一部（筋芽細胞および分化細胞）は、1 時間のストレッチ後に MAPK 経路によって活性化されます。 Fos は、運動に応答して高度に上方制御され、転写を含むさまざまな細胞プロセスに関与する早期応答遺伝子です 51。 Ctgf は別の運動早期応答遺伝子であり、CTGF は筋線維に動員され、マトリックスタンパク質のリモデリングを促進すると考えられます 27。 筋芽細胞と分化した細胞の両方で 1 時間の伸長後にこれら 2 つの遺伝子が強力に活性化することは、転写プログラムを介して伸長反応を調節する際の MAPK 経路の役割を示唆しています。 興味深いことに、ERK1/2 リン酸化が阻害されると、いくつかの MAPK 標的は細胞伸張に対する反応の消失を示し、MAPK が実際に転写調節に関与していることを示しました。

これまでの研究では、他のスプライシング因子と相互作用するMAPKシグナル伝達が、選択的スプライシングが機械的力にどのように反応するかを理解する鍵であると仮説を立てていたが、これは証明されていない。 C. elegans で行われた最近の研究では、スプライシング因子 MBNL1 の喪失により MAPK の活性が低下し、下流のスプライシングおよび遺伝子発現プログラムに影響を与えることが実証されました 52。 我々の研究では、伸長時のERK1/2の活性化とその後の転写標的への影響は、MAPK経路が他のスプライシング因子と相互作用してそれらの変化を引き起こしている可能性があることを示唆している。

細胞を 1 時間および 3 時間伸長すると、分化した筋細胞におけるスプライシング イベントの総数が増加し、除外よりも多くのエクソンの包含に移行しました。 SR タンパク質は、エクソンインクルージョンのよく知られたプロモーターです 53,54。 私たちの RNA-seq 研究により、SR タンパク質の mRNA 発現レベルが他の RBP ファミリーよりもストレッチに反応することが明らかになりました。 SR タンパク質はリン酸化されると、スプライシングの活性化、スプライシングの抑制、転写、翻訳、mRNA の輸出などのさまざまな細胞プロセスを制御します 40。 私たちが発見した機械感受性カセットエクソンは、SRタンパク質の2つの主な機能である転写とリン酸化に関与するタンパク質をコードする遺伝子に存在します。 これは、伸長に応答するスプライシング事象が SR タンパク質と同様の機能に関与しており、SR タンパク質によって調節されている可能性があるという考えに信憑性を与えます。

私たちのデータは、SRSF4が機械感受性RBPであることを示唆しています。これは、ストレッチによりリン酸化レベルが変化し、それが下流の転写および転写後の標的に影響を与える可能性があるためです。 実際、伸張（転写およびスプライシングレベル、我々の研究）に応答する遺伝子と、SRSF4の標的として知られている遺伝子との間には、強い重複があった43。 骨格筋細胞は機械的シグナルを統合する必要があるため、伸張時の SRSF4 のリン酸化変化は、機械的力に応答して機械的伝達に影響を与える SR タンパク質修飾コードを持つことが可能であるという考えを裏付けています 40。

MAPK 経路のプレーヤーは、一部の SR タンパク質およびその標的の上流のキナーゼと相互作用します42、55、56。 興味深いことに、SRSF4 の過剰発現と細胞伸長に応答した遺伝子とスプライシング イベントのいくつかは、MAPK 経路内にあります。 これは、転写および転写後標的の機械的伸張誘発性変化を介してMAPK経路と相互作用するSRSF4の役割を示唆している。

選択的スプライシング プログラムは、さまざまな筋疾患で誤って制御されています 57,58,59。 多くの研究により、スプライシングの変化が骨格筋疾患の特定の特徴や生理学的欠陥と関連付けられ、原因となる RBP が特定されています 3,4,57,59。 筋肉や心臓などの機械感受性組織は、発生中に高レベルの選択的スプライシングを示します2,14。 したがって、横紋筋疾患に対するより多くの治療選択肢を提供するには、機械伝達が選択的スプライシング制御にどのような影響を与えるかを理解することが重要です。 マウスやヒトでの筋肉の伸張実験では不均一性が見られることが多く、伸張の分子機構を解析することが困難です60,61。 したがって、シャーレ内で増殖させた筋細胞の研究を筋組織に外挿することはできませんが、組織における将来の研究のターゲットを明確にするために、筋細胞の基本的な分子機構を調べることには依然として多くの価値があります。

SRSF4 は乳がんにおいて役割を果たし、横紋筋におけるいくつかの機械感受性タンパク質のスプライシングを調節します 43,62,63。 乳がんの 8% では SRSF4 が変異しており、その結果、重要ながん形質転換遺伝子のミススプライシングが生じています 43。 さらに、MCF-10A 腺房構造における SRSF4 の過剰発現は、下流の遺伝子発現とスプライシング プログラムを誤って制御し、SRSF4 を重要な制御因子として確立しました 43。 さらに、HeLa 細胞における SRSF4 の枯渇により、運動ニューロン 2 (SMN2) pre-mRNA の生存におけるエクソン 7 の含有量が大幅に増加しました62。 SMN2 エクソン 7 の組み込みを改善することが、SMN タンパク質欠損を引き起こす SMN1 遺伝子の欠損によって引き起こされる脊髄性筋萎縮症患者の治療戦略の目標であるため、これは重要です。 SMN2 は SMN1 とほぼ同一ですが、エクソン 7 がスキップされると、機能不全に切断された SMN2 タンパク質が生成されるため、SMN1 の損失を補うことができません。

心臓では、SRSF4 は機械感受性心筋トロポニン T 遺伝子のエクソン組み込みを促進しました 63。 マウスの心臓における SRSF4 のノックアウトは、グルココルチコイドシグナル伝達の変化とともに、心室肥大と心筋細胞面積の拡大を引き起こしました 64。 分化した筋細胞において、3 時間および 6 時間のストレッチ後の機械感受性遺伝子が、ステロイド代謝に関与するタンパク質をコードしていることを観察しました。これは、心臓におけるステロイドシグナル伝達における SRSF4 の役割を考慮すると興味深いものです 64。 さらに、SRSF4を欠くマウスの心臓は広範なスプライシング変化を示さなかったが、心筋内でSRSF6タンパク質の増加を示し、これら2つのSRタンパク質が心臓組織内の同様の標的を調節している可能性があることを示唆している64。 我々の研究では、SRSF4またはSRSF6の過剰発現の標的でストレッチした後に転写後遷移を起こす遺伝子間の重複が実証され、これら2つのRBPが同様のスプライシング事象を調節している可能性があることが示唆された。 さらに、リン酸化 SRSF4 の増加と同様に、3 時間の細胞伸張後にリン酸化 SRSF6 の有意な増加が観察されました。 全体として、これらの研究と我々のデータは、機械感受性のある特定の遺伝子の発現とスプライシングの調節における SRSF4 の潜在的に重要な役割を裏付けています。

筋疾患は、筋細胞のスプライシングと物理的特性の両方に根本的な変化をもたらします。 原因不明の筋肉の病変はまだ数多くあります。 私たちの知る限り、これは骨格筋細胞における偏りのないRNA-seqアプローチによる機械的ストレッチによる全体的な転写および転写後の変化を調査した最初の研究です。 我々は、SRSF4のリン酸化が機械感受性であり、他のRBPが骨格筋細胞の伸張に応答することが記載されていないことを発見しました。 SRSF4は、MAPKシグナル伝達経路と相互作用することにより、筋肉における機械的伝達と選択的スプライシングネットワーク間の分子クロストークにおいて役割を果たしている可能性がある。 これは、筋疾患で起こる分子的変化と機械的変化の同時発生との関係を理解するための重要なステップとなる可能性があります。 SRSF4 は、転写および転写後制御に対する影響がすでに確立されており、MAPK カスケードを介した機械伝達における新たな役割が期待できるため、将来の研究対象として魅力的です。

C2C12 マウス筋芽細胞は ATCC (CRL-1722) から購入し、マイコプラズマ陰性であることが確認されました。 細胞は、筋芽細胞および分化した細胞内の既知の筋原性マーカーをリアルタイム PCR (qPCR) によってプロファイリングすることによって認証されました。 筋芽細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン、100 単位/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で、5% CO2 下、37 °C で培養しました。 細胞は低コンフルエント (30 ～ 40%) に維持されました。 分化を誘導するために、90% コンフルエントの細胞をリン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄し、2% ウマ血清、2 mM グルタミン、100 単位/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した DMEM で培養しました。

C2C12 筋芽細胞を、BioFlex Collagen 1 6 ウェル プレート (Flexcell International、BF-3001 C) (筋芽細胞の研究では 1 ウェルあたり 50,000 細胞、分化細胞の研究では 1 ウェルあたり 200,000 細胞) に、10% FBS を添加した DMEM 中でプレーティングしました。単位/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、および 2 mM グルタミン。 伸長していない細胞も、BioFlex Collagen 1 6 ウェル プレートにプレーティングし、伸長の期間を除いて伸長した細胞とまったく同じ培養条件に供しました。 細胞を 4 日間分化させた後、FX-6000T Tension システム (Flexcell International) を使用して 1 時間、3 時間、または 6 時間伸長するか (分化細胞)、または 2 日後に 1 時間、3 時間、または 6 時間伸長しました。メッキ（筋芽細胞）。 ストレッチプロトコルは次のとおりです: 1/2 サイン、16% 等二軸ストレッチ、DC = 50%、および FREQ = 1 Hz。 Flexcell の技術レポートによると、16% の伸びは 0.16 のひずみと -69.5 の圧力 (kPa) に相当します。 伸長した細胞と伸長していない細胞の両方を、RNA 抽出またはタンパク質溶解物の調製前に PBS で洗浄しました。

RNA-seq実験では、細胞をPBSで洗浄し、メーカーのプロトコールに従ってDNaseステップ（Qiagen、#79254）を含むQiagenのRNeasy Mini Kit（#74104）を使用してRNAを抽出しました。 他の実験では、メーカーのプロトコールに従って、細胞を PBS で洗浄し、TRIzol 試薬を使用して全 RNA を抽出しました。

RNA-seq によって分析された RNA サンプルは、次の品質パラメーターを満たしました: DV200 > 95、r28S:18 S > 2.8、および RNA 統合数 (RIN) > 8.4。 ライブラリーの調製には、Kapa mRNA 鎖法を使用しました。 すべてのサンプルをプールし、最初にライブラリを Illumina MiSeq Nano で実行して、シーケンスの品質を検証しました。 品質検証後、ライブラリは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のハイスループットシーケンシングコアで、ペアエンド 2 × 100 サイクル実行の NovaSeq 6000S4 シーケンサーの 4 レーンにわたる 1 つのフローセルで実行されました。

サンプルは、STAR65 を使用してサンプルを Ensembl mm10 ゲノムおよび Ensembl mm10 トランスクリプトームにアラインメントする UNC-CH jUNCtion プログラムを使用して処理し、Salmon プログラム 66 を使用して下流分析のために発現を定量しました。 マッピング率の詳細は補足データ 1 に記載されています。遺伝子発現は DESeq267 を使用して計算されました。 Benjamini-Hochberg 調整済み p 値が 0.05 未満であり、|log2FoldChange | である場合、遺伝子は差次的に発現しているとみなされました。 ≥0.58 (上方制御された遺伝子の場合は変化倍数 >1.50、または下方制御された遺伝子の場合は変化倍数 <-1.50)。 筋芽細胞の遺伝子発現の重大な変化は補足データ 2 に、分化細胞の遺伝子発現の重大な変化は補足データ 3 にあります。伸張に応答したディファレンシャルオルタナティブスプライシングを決定するために、リードを参照染色体、足場を含む Gencode mm10 ゲノムおよび Gencode vM20 トランスクリプトームにアライメントしました。 、アセンブリパッチ、およびハプロタイプ。 差次的スプライシングは MISO を使用して決定され、各時点でのすべてのサンプルの MISO 概要カウントを含むデータセットが作成されました 35。 次に、これらのデータセットを使用して、各時点でストレッチされたサンプルとストレッチされていないコントロールを比較しました。 イベントは、合計リード深度 ≥15、および包含リード ≥5 または除外リード ≥5 によってフィルターされました。 フィルタリング後、|ΔPSI| の場合、イベントは選択的にスプライスされたと見なされます。 (|PSIstretch–PSIno ストレッチ|) >10、Wilcox p 値 (ストレッチ vs ストレッチなし) ≤0.05。 筋芽細胞の選択的スプライシングの重要な変化は補足データ 4 にあり、分化細胞の変化は補足データ 5 にあります。 Excel ファイルでは、ΔPSI 値は 0 ～ 1 (包含の場合) または 0 ～ -1 (包含の場合) のスケールで表示されます。除外）。

GO エンリッチメント分析は、Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) を使用して、細胞伸張に応答して mRNA レベルまたは選択的スプライシング パターンを変化させる遺伝子に対して実行されました 68,69。 前のセクションで定義した差次的発現遺伝子を GO に利用しました。 伸張時に変化する遺伝子の GO 解析の -log10 調整 p 値は、DAVID から出力された Benjamini-Hochberg 調整 p 値から計算されました。 調整された p 値 0.25 による GO 分析は、GO70 の仮説生成のしきい値として広く受け入れられています。 伸長時に変化する遺伝子の経路解析の -log10 p 値は、DAVID から出力された p 値から計算されました。 前のセクションで定義した遺伝子 (差次的にスプライシングされたエクソンが存在する) を GO に利用しました。 スプライシング レベル (カセット エクソン) で変化する遺伝子の GO 解析からの -log10 ランク付けされた p 値は、DAVID から出力されたランク付けされた p 値から計算されました。

High-Capacity cDNA Reverse Transcription キット (Applied Biosystems、#4368813) を使用して、ヌクレアーゼフリー H2O および RNase 阻害剤 (Applied Biosystems、N8080119) を使用して RNA を cDNA に逆転写しました。 cDNA合成には次のプログラムを使用しました：（i）25℃で10分間、（ii）37℃で120分間、（iii）85℃で5分間、（iv）4℃で一時停止。

PCR アッセイは、GoTaq グリーン マスター ミックス (Promega、M7123) と、選択的にスプライスされた領域に隣接する構成エキソンを標的とするマウス プライマー (0.5 μM) を使用して実行されました (補足データ 6)。 以下の増幅条件を使用しました: (i) 95 °C で 1 分 15 秒、(ii) 95 °C で 45 秒、57 °C で 45 秒、72 °C で 1 分間を 28 サイクル、(iii) 72 °Cで10分間、(iv) 4°Cで一時停止します。 PCR産物は、TBE緩衝液（89 mM Tris、89 mM ホウ酸、2.5 mM EDTA、pH 8.3）中の6％ポリアクリルアミドゲルを使用し、140 Vで4時間電気泳動によって分離しました。ゲルは水溶液中で10分間染色しました。 0.4 μg/mL 臭化エチジウム溶液を使用し、ChemiDocTM XRS + イメージング システム (BioRad) を使用して視覚化しました。 スプライシングゲルは、Image LabTM 6.0.1 ソフトウェア (BioRad) を使用した濃度測定によって定量されました。

25 ～ 100 ng の cDNA を利用して、Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific、#4444557) を使用して 20 µL qPCR 反応を実行しました。 QuantStudio 7 マシンを次のプロトコルで使用しました: (1) 50 °C で 2 分間。 (2) 95 °C で 20 秒間。 (3) 95 °C で 1 秒。 (4) 60℃で20秒間。 筋芽細胞および分化細胞の qPCR 検証のサイクル閾値 (補足表 1) は、ヒドロキシメチルビラン シンターゼ (Hmbs) (Mm01143545-m1、アンプリコン サイズ 81 bp; Thermo Fisher Scientific) に対して正規化されました。 伸長サンプルは、同じ時点の非伸長サンプルに対して正規化されました。 U0126 処理後の qPCR のサイクル閾値 (補足表 1) は、リボソームタンパク質 L13a (Rpl13a) (Mm01612986_gH、アンプリコン サイズ 122 bp; Thermo Fisher Scientific) に対して正規化されました。 サンプルはビヒクルに対して正規化されており、ストレッチサンプルはありません。

細胞を伸長直後に氷上に置き、プロテアーゼ (Roche、#11697498001) およびホスファターゼ阻害剤 (Sigma Aldrich、#4906845001) を含む氷冷 PBS で洗浄し、氷冷 RIPA バッファー (50 mM Tris、150 mM NaCl、1) で溶解しました。 % Triton X-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、pH 7.5)、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む (Thermo Fisher Scientific、#1861281)。 ライセートを氷上で 15 分間インキュベートし、その後 75% 振幅で 3 分間超音波処理し (30 秒オン、30 秒オフ)、氷上でさらに 15 分間インキュベートし、14,000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清を新しいチューブに移し、-80 °C で保存しました。 タンパク質濃度は、Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Fisher Scientific、#23225) の製造業者のプロトコールに従って測定されました。

等量のタンパク質をローディングバッファー（50 mM Tris-HCl pH 6.8、12.5 mM EDTA、10% グリセロール、2% SDS、0.02% ブロモフェノールブルー、360 mM ベータ-メルカプトエタノール）で希釈しました。 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を使用して、192 mM グリシン、25 mM Tris 塩基、および 3.5 mM SDS を含む緩衝液を利用して、4 ～ 15% mini-Protean TGX 無染色ゲル (BioRad、#4568084) 上のサンプルを分析しました。 、ｐＨ８．３。 電気泳動は90Vで30分間、続いて150Vで30分間実施した。 ゲルを ChemiDocTM XRS + イメージング システム (BioRad) でイメージングし、タンパク質を Amersham Hybond Low Fluorescent 0.2 µm PVDF メンブレン (GE Healthcare Life Sciences、#10600022) に 192 mM グリシンを含む転写バッファーを使用して 100 V で 1 時間転写しました。 、２５ｍＭトリス、および２０％メタノール、ｐＨ８．３。 ChemiDoc Imaging System (BioRad) を使用して膜を画像化し、総タンパク質を推定しました。 膜を、トゥイーン（TBST）（20 mM トリス塩基、137 mM NaCl、0.1% トゥイーン 20、pH 7.6）を含むトリス緩衝生理食塩水中の 5% 脱脂粉乳または 1% ウシ血清アルブミンのいずれかを用いて、室温で 1 時間ブロックしました。 (BSA) TBST。 膜をTBSTで洗浄し、以下のようにTBST中の1% BSAで希釈した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました: Cell Signalingの抗リン酸化ERK1/2 (#4370、1:2,000)、Cellの抗ERK1/2シグナリング (#4695、1:2,000)、Millipore Sigma の抗 SRSF4 (#06-1367、1:500)、Millipore Sigma の抗 SRSF5 (#06-1365、1:500)、Byl Laboratories の抗 SRSF6 (A303-669A-T、1:1,000)、および Sigma Aldrich の抗リン酸化 SR タンパク質 (MABE-50、1:750)。 翌日、メンブレンをTBSTで3回（各10分）洗浄し、二次抗マウスDylight 800（Thermo Fisher Scientific、SA5-35521）または抗ウサギDylight 800（Thermo Fisher Scientific、SA5-35571）とともにインキュベートしました。抗体を 1% BSA の TBST 溶液で 1:10,000 に希釈し、暗所、室温で 1 時間振盪しました。 膜は Odyssey Licor Imager で画像化されました。

C2C12細胞を4日間分化させ、その後伸長前に20μMのERK1/2リン酸化阻害剤(Promega、U0126)とともに30分間インキュベートした。 ERK1/2 リン酸化阻害剤で処理されていない細胞を、ジメチルスルホキシド (DMSO) (媒体) で処理しました。 細胞を1時間伸長させた。 タンパク質と RNA は、その後の分析のためにすぐに単離されました。

筋芽細胞の RNA-seq の場合、サンプルは 2 つの独立した実験から収集されました (各実験から 2 つの別々のサンプル、つまり合計 4 つのサンプル)。 分化細胞の RNA-seq の場合、サンプルは 3 つの独立した実験から収集されました (1 つの実験から 2 つの別々のサンプル、他の 2 つの独立した実験から 1 つのサンプル、つまり合計 4 つのサンプル)。 他のすべての実験では、少なくとも 3 つの独立した生物学的複製が生成されました。 統計解析の種類と反復回数は、各図の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

現在の研究中に生成された RNA-seq データは、GEO リポジトリでアクセッション番号 GSE190029 で入手できます。 各図のソース データは https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.6134205.v2 で入手できます。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04064-7

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、スタートアップ基金 (JG) とノースカロライナ大学チャペルヒル校、国立衛生研究所 (NIH) R01 (NIH-NIGMS R01GM130866) (JG) からのジェファーソン パイロット賞 (JG) によって支援されました。国立トランスレーショナルサイエンス推進センター (NCATS) (JG) からの NCTraCs パイロット助成金 (550KR181805)、および米国心臓協会からのキャリア開発賞 (19CDA34660248) (JG)。 ERH は、NIH-NIAMS F31 博士前フェローシップ (F31AR077381) および NIH-NIGMS 研修賞 (5T32 GM007092) によって支援されました。 ノースカロライナ大学チャペルヒル校のハイスループットシーケンシング施設からの技術支援に感謝します。この施設は、大学がん研究基金、包括的がんセンター中核支援助成金 (P30-CA016086)、および UNC メンタルヘルスセンターによって支援されています。および感受性付与 (P30-ES010126)。 MC は、NIH-NIAMS F31 博士前フェローシップ (1F31HL145983-01) によって支援されました。 JMT は NIH-NHLBI R01 (1R01HL142879) によってサポートされました。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはその他の資金源の公式見解を表すものではありません。 ノースカロライナ大学チャペルヒル校のバイオインフォマティクスコアには、このプロジェクトとデータ分析のための jUNCtion プログラム中の継続的な支援に感謝します。 私たちは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の遺伝学および分子生物学カリキュラム (GMB) の支援に感謝します。 このプロジェクトに関して数多くの貴重な議論をしていただいた Keith Burridge 博士に特に感謝いたします。

ノースカロライナ大学チャペルヒル校、細胞生物学および生理学学部、チャペルヒル、27599、NC、米国

エマ・R・ヒンクル、R・エリック・ブルー、ジャクリーン・デイヴィ、ジメナ・ジュディス

遺伝学および分子生物学のカリキュラム (GMB)、ノースカロライナ大学チャペルヒル校、チャペルヒル、27599、NC、米国

エマ・R・ヒンクル、ジョエル・S・パーカー、ジメナ・ジュディス

ラインバーガー総合がんセンター、ノースカロライナ大学チャペルヒル校、チャペルヒル、27599、NC、米国

ツァイ・イーシュアン、アリーシャ・R・コーフィー、ジョエル・S・パーカー

ノースカロライナ大学チャペルヒル校病理学および検査医学科、チャペルヒル、27599、NC、米国

マシュー・コムズ & ジョアン・M・テイラー

米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学医学部

アラジン・M・ボリーク

マカリスター心臓研究所、ノースカロライナ大学チャペルヒル校、チャペルヒル、27599、NC、米国

ジョアン・M・テイラー & ジメナ・ジュディス

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ERH はすべての実験作業を実行し、RNA-seq データを分析しました。 REB は、いくつかのストレッチ実験を支援し、SR タンパク質のいくつかのウェスタンブロットおよび qPCR アッセイを実行し、査読者のコメントに対処するためのウェスタンブロッティング実験を支援しました。 YHT MISO データの分析と解釈に貢献しました。 JD は qPCR 分析を支援しました。 ARC は、MISO 分析用のコードを提供しました。 AMB はプロジェクトの初期段階でストレッチ プロトコルを提供しました。 三菱商事は、Flexcell 機器の使用時のトレーニングとサポートを提供しました。 JMT は原稿のアイデア創出を支援しました。 JSP は ERH のバイオインフォマティクスの訓練と監督を行い、RNA-seq データの解釈を支援しました。 JG がこの研究を企画、監督しました。 ERH と JG が原稿草稿を書きました。 著者全員が最終原稿に貢献し、それに同意しました。

ヒメナ・ジュディスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Marco Fritzsche と Eve Rogers。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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ヒンクル、ER、ブルー、RE、ツァイ、YH。 他。 筋細胞を伸ばすと、転写およびスプライシングの移行と SR タンパク質の変化が誘発されます。 Commun Biol 5、987 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03915-7

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受信日: 2022 年 4 月 14 日

受理日: 2022 年 8 月 30 日

公開日: 2022 年 9 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03915-7

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